Протеомика - функциональная наука, основным предметом изучения которой является протеом. Протеом представляет собой весь набор белков, которые продуцируются или модифицируются организмом или системой. Протеомика - это наука, изучающая виды белка, а потому она помогла открыть множество новых видов этого соединения - гораздо больше, чем было известно до ее возникновения как науки. Количество белков, как оказалось, зависит от времени и различных требований или стрессов, которым подвергаются клетки или организмы. Протеомика - это междисциплинарная область, которая в значительной степени предопределена новейшими проектами по изучению генома. Она охватывает исследование протеомов из общего уровня белкового состава, структуры и активности. Функциональная протеомика часто называется самым важным компонентом функциональной геномики.
Дать определение протеомики не так просто, как может показаться на первый взгляд. Эта наука обычно подразумевает крупномасштабный экспериментальный анализ белков и протеомов, но часто используется для изучения возможностей очистки белков.
После геномики и транскриптомики протеомика является следующим шагом в изучении биологических систем. Она гораздо сложнее, чем геномика, потому что геном организма более или менее постоянен, тогда как протеом отличается от клетки к клетке и время от времени. Отдельные гены экспрессируются в разных типах клеток, а это означает, что даже основной набор белков, которые продуцируются в клетке, необходимо идентифицировать.
Протеомика изучения структуры белков - направление в биохимии, выделившееся относительно недавно. В прошлом исследования белков проводились с помощью анализа РНК, но оказалось, что структура РНК никак не коррелирует с содержанием белка. Известно, что мРНК не всегда транслируется в белок, а количество белка, продуцируемого для данного количества мРНК, зависит от того, какой ген транскрибируется, а также от текущего физиологического состояния клетки. Протеомика - это наука, которая подтверждает наличие белка и обеспечивает прямую оценку присутствующего количества.
Мало того, что извлечение белка с мРНК вызывает его повреждение, но, кроме того, многие белки также подвергаются широкому спектру химических модификаций после этого процесса. Многие из этих посттрансляционных модификаций имеют решающее значение для функции белка.
Одной из таких модификаций является фосфорилирование, которое происходит со многими ферментами и структурными белками в процессе клеточной передачи сигналов. Добавление фосфата к определенным аминокислотам, чаще всего серинам и треонину, опосредуемым серин / треонинаминазами или реже тирозином, опосредованным тирозинкиназами, заставляет молекулу белка стать мишенью для связывания или взаимодействия с различным набором других молекул, которые распознают фосфорилированный домен.
Поскольку фосфорилирование белка является одной из наиболее изученных его модификаций, многие «протеомические» усилия направлены на определение набора фосфорилированных белков в конкретной клетке или тканевом типе при определенных обстоятельствах.
Убиквитин представляет собой небольшой белок, который может быть прикреплен к определенным субстратам ферментами, по-научному называемыми E3 ubiquitin-ligases. Определение того, какие белки являются поли-убиквитинированными, помогает понять, как регулируется движение молекул этого вещества. Аналогичным образом, как только исследователь определяет, какие субстраты убиквитированы каждой лигазой, полезно определить набор лигаз, выраженных в конкретном типе клеток.
Помимо фосфорилирования и убиквитинирования, белки могут быть подвергнуты (в частности) метилированию, ацетилированию, гликозилированию, окислению и нитрозилированию. Некоторые белки подвергаются всем этим изменениям, часто в зависящих от времени комбинациях. Это иллюстрирует потенциальную сложность изучения структуры и функции белка.
Отдельные белки производятся в разных условиях. Клетка может создавать разные наборы белков в разное время или в разных условиях, например, во время развития, клеточной дифференциации, клеточного цикла или канцерогенеза. Дальнейшее увеличение сложности протеома, как уже упоминалось, подразумевает, что большинство белков могут подвергаться широкому спектру посттрансляционных модификаций.
Поэтому исследования в области протеомики - это в перспективе сложная задача, даже если тема изучения этой науки по-прежнему будет ограниченной. При более амбициозных задачах, например, когда ищут биомаркер для конкретного подтипа рака, ученый-протеомист может выбрать изучение нескольких образцов сыворотки крови у нескольких пациентов с раком, чтобы свести к минимуму смешивающие факторы. Таким образом, сложные экспериментальные конструкции иногда необходимы для учета динамической сложности протеома.
Протеомика дает разные уровни понимания, чем геномика по многим причинам:
Одним из основных факторов, влияющих на воспроизводимость экспериментов в протеомике, является одновременное элюирование многих других пептидов, которые могут быть измерены масс-спектрометрами. Это приводит к стохастическим различиям между экспериментами из-за зависящего от данных приемов триптических пептидов. Хотя ранние крупномасштабные анализы протеома дрожжей показали значительную изменчивость в результатах между различными лабораториями, по-видимому, частично из-за технических и экспериментальных различий между ними, воспроизводимость была улучшена в более позднем масс-спектрометрическом анализе, особенно при использовании масс-спектрометров.
В протеомике существует множество методов изучения белков. Как правило, они могут быть обнаружены с использованием антител (иммунологических анализов) или при помощи масс-спектрометрии. Если анализируется сложный биологический образец, необходимо либо использовать очень специфическое антитело в количественном метоп-блот-анализе (qdb), либо биохимическое разделение.
Антитела к конкретным белкам или их модифицированным формам использовались в исследованиях биохимии и клеточной биологии. Они относятся к числу наиболее распространенных инструментов, используемых сегодня молекулярными биологами. Существует несколько конкретных методов и протоколов, которые предплагают использование антител для обнаружения белка. В течение десятилетий фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) использовался для их обнаружения и количественного измерения в образцах биологического вещества. Вестерн-блот может быть использован для обнаружения и количественного определения отдельных белков, где на начальном этапе сложную органическую смесь разделяют с использованием SDS-PAGE, а затем интересующий белок идентифицируют с использованием антитела.
Модифицированные белки могут быть изучены путем разработки антитела, специфичного для этой модификации. Например, существуют антитела, которые только распознают определенные белки, когда они являются тирозинфосфорилированными, известными как фосфоспецифические антитела. Кроме того, существуют антитела, специфичные для других модификаций. Они могут быть использованы для определения набора белков, подвергнувшихся модификации.
Обнаружение заболеваний на молекулярном уровне является движущей силой новой революции в области диагностики и лечения. Технология цифрового иммуноанализа улучшила чувствительность обнаружения молекул до так называемого аттомолярного диапазона. Эта возможность дает нам потенциал для открытия новых достижений в области диагностики и терапии, но такие технологии были отнесены к ручным процедурам, которые не очень хорошо подходят для эффективного ежедневного использования.
Хотя обнаружение белка с антителами все еще очень распространено в молекулярной биологии, были разработаны и другие методы, которые не полагаются на антитело. Эти методы предлагают различные преимущества, например, они часто могут определять последовательность белка или пептида, они могут иметь более высокую пропускную способность, чем антитело, и иногда они могут идентифицировать и количественно определять белки, для которых не существует антител.
Одним из самых ранних методов анализа белка была деградация Эдмана (введена в 1967 году), где один пептид подвергается нескольким стадиям химического разложения, чтобы определить его последовательность. Эти методы в основном были вытеснены технологиями, которые обеспечивают более высокую пропускную способность. От методов зависят и различные направления протеомики.
Для анализа сложных биологических образцов требуется снижение их сложности. Это можно выполнить сделать с помощью одномерного или двухмерного разделения. Совсем недавно были разработаны онлайн методы, в которых индивидуальные пептиды были разделены с использованием хроматографии с обращенной фазой, а затем непосредственно ионизированы с использованием метода ESI.
Существует несколько гибридных технологий, которые используют очистку отдельных аналитов на основе антител, а затем проводят масс-спектрометрический анализ для их идентификации и количественной оценки. Примерами этих методов являются метод MSIA (масс-спектрометрический иммуноанализ), разработанный Рэндалом Нельсоном в 1995 году, и метод SISCAPA (стабильный изотопный стандартный захват с антипептидными антителами), введенный Ли Андерсоном в 2004 году.
Сравнительный протеомический анализ может выявить роль белков в сложных биологических системах, включая размножение. Например, лечение инсектицидом триазофосом приводит к увеличению содержания коричневых саженцев (Nolaparvata lugens (Stål)) - мужских вспомогательных железных белков (Acps), которые могут быть переданы самкам посредством спаривания, что приводит к увеличению фертильности (т.е. плодовитости) женщин. Чтобы выявить изменения в типах белков вспомогательных желез (Acps) и репродуктивных белков, полученных от самцов кузнечиков, исследователи провели сравнительный протеомический анализ спящих самцов вида N. lugens. Результаты показали, что эти белки участвуют в репродуктивном процессе взрослых самок и самцов кузнечиков N. lugens.
Протеомика - это наука, которая неуклонно набирала обороты в течение последнего десятилетия. Многие из подходов, разработанных этой наукой, абсолютно революционны, некоторые же основываются на старых научных методах. Методы на основе масс-спектрометрии и микроячейки являются наиболее распространенными технологиями для крупномасштабного изучения белков.
В настоящее время для профилирования белка используются два метода масс-спектрометрии. Более известный и широко распространенный метод использует двумерный электрофорез с высоким разрешением для разделения белков из разных образцов параллельно с последующим отбором и окрашиванием дифференцированных экспрессированных белков, которые должны быть идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. Несмотря на достижения в 2DE и общей проработанности этого метода, он также имеет свои пределы. Основной проблемой является неспособность идентифицировать все белки в образце, учитывая их вариативность и прочие уникальные свойства.
Второй количественный подход использует стабильные метки изотопа для дифференцированных меток белков из двух различных сложных смесей. Здесь белки в сложной смеси сперва помечаются изотопами, а затем расщепляются с получением меченых пептидов. Затем меченые смеси объединяют, причем пептиды разделяют многомерной жидкостной хроматографией и анализируют с помощью тандемной масс-спектрометрии. Изотопно-кодированные метки (ICAT) представляют собой широко используемые изотопные метки. В этом научном методе цистеиновые остатки белков ковалентно присоединяются к реагенту ICAT, тем самым снижая сложность смесей, исключающих остатки, отличные от цистеина.
Протеомика, геномика, метаболомика - новые направления в биологии, отличающиеся сложностью и инновационностью. Далеко не каждому под силу их изучение.
НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ
С.В. Сучков12, Д.А. Гнатенко1, Д.С. Костюшев1, С.А. Крынский1, М.А. Пальцев3
1 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Российская Федерация 2 Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, Российская Федерация
3 РНЦ «Курчатовский институт», Москва, Российская Федерация
Протеомика как фундаментальный инструмент доклинического скрининга, верификации анализов и оценки применяемой
Протеомика - наука, изучающая белки живых организмов, их функции и взаимодействие, на сегодняшний день является незаменимым компонентом в создании протоколов доклинической диагностики. В сочетании с достижениями геномики, биоинформатики, использование технологий протеомики - мощный инструмент ранней диагностики заболеваний, а также динамической оценки протекания патологических процессов (в частности, на фоне проводимой фармакотерапии). В статье рассмотрены общие и частные аспекты протеомики, основанные на базе моделей кардио- и онкозаболеваний.
Ключевые слова: протеомика, диагностика, предикция, трансляционная медицина.
Введение
Известно, что абсолютное большинство патологических изменений в функционировании клеток, тканей и органов сопровождается отклонением от физиологического белкового профиля нормального здорового организма. В современных условиях анализ и прогнозирование подобных изменений выходят на первый план при создании протоколов доклинического скрининга (т.е. определение скрытых и латентных белковых «предвестников» заболевания, а также оценка эффективности применяемых методов терапии). Поиск, определение, разделение, количественное и качественное определение белковых молекул, играющих роль в обеспечении чувствительности либо непосредственно в формировании заболевания, являются основными задачами протеомики.
Протеомика (англ. proteomics) - наука, изучающая белковый состав биологических объектов, а также структурно-функциональные свойства белковых молекул. Ее задачей является идентификация и количественное определение совокупных индивидуальных белков, которые содержатся в биологических образцах (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча, биоптаты) на разных стадиях развития заболевания, а также на фоне проводимой терапии. Совокупность всех белков организма, т.е., по сути, его белковый профиль, носит название «про-теом».
Современный технологический арсенал протеомики
Фракционирование и разделение белков, содержащихся в конкретном биологическом образце, осуществляют
S.V. Suchkov1,2, D.S. Kostushev1, S.A. Krynskiy1, D.A. Gnatenko1, M.A. Paltsev3
1 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Russian Federation 2 A.I. Evdokimov Moscow State Medical Dental University, Russian Federation 3 Kurchatov’s Scientific Institute, Moscow, Russian Federation
Proteomics as a fundamental tool for subclinical screening, tests verification and assessment of applied therapy
Proteomics is a science which studies proteins of the body, interactions of proteins and their biological functions. Today, it is an essential partner in establishingpreclinical diagnosis protocols. In conjunction with other sciences such as genomics and bioinformatics it will be possible to diagnose diseases on the earliest stages before its clinical onset or to gain the dynamics of pathological processes in the body and response to drug therapy. This article discusses general aspects of proteomics as well as special ones on the basis of models of cardiac diseases and cancer.
Key words: proteomics, diagnostics, prediction, translation medicine.
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 1
посредством электрофореза в полиакриламидном геле. Для идентификации же выделенных белков применяют широкую панель методов, среди которых следует выделить:
Микросеквенирование белков;
Жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC) и высокого разрешения;
Методы иммунохимического тестирования с использованием моноклональных антител к индивидуальным антигенным детерминантам;
Масс-спектрометрию.
В последние годы процедуру детекции белковых молекул существенно оптимизировали, разработав для этой цели широкую панель микробиочипов с различными типами детекции, например SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization) и/или MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization). Подходы такого рода позволили анализировать одновременно до 10 000 индивидуальных белков в одном образце, фиксируя при этом мельчайшие сдвиги в их концентрациях под влиянием различных факторов. В итоге, если белки различаются хотя бы по одному из присущих им параметров (суммарному заряду молекулы или молекулярной массе), вышеуказанный подход позволяет добиваться их разделения с последующей идентификацией и характеристикой.
Одним из наиболее перспективных методов идентификации белков является масс-спектрометрия, основанная на формировании в вакуумном пространстве ионизированных частиц анализируемого вещества с последующим анализом отношения массы ионов к их заряду. Существуют различные модификации масс-спектрометрии, которые подразделяются в зависимости от используемых методов ионизации и детекции частиц. Время-пролетный масс-спектрометр регистрирует отдельные ионы с указанием значения отношения массы к заряду (m/z) иона, числа ионов и времени пролета ионов от источника до детектора ионов .
Меньшим разрешением обладают хроматографические методы, позволяющие осуществить разделение белков по физическим свойствам молекул: заряду (ионообменная хроматография), параметрам гидрофоб-ности (гидрофобная хроматография), размеру (гель-фильтрация), способности к связыванию с различными лигандами, например антителами (аффинная хроматография). Речь в этих случаях идет о вариантах жидкостной хроматографии, т.к. в газовой фазе молекулы белка не существуют. В протеомном анализе часто используют комбинацию масс-спектрометрии и жидкостной хроматографии (хромато-масс-спектрометрия): то есть, по сути, создание и внедрение в практику масс-спектрометрии привело к скачку в развитии протеомики.
Наконец, к методам протеомики относится иммунохимический анализ с использованием моноклональных антител к индивидуальным антигенным детерминантам, к линейным и конформационно-зависимым, включая ряд криптических эпитопов.
Важную роль при работе со срезами тканей играют иммуногистохимические методы исследования, основанные на специфических взаимодействиях антиген-антитело. Иммуногистохимические методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, позволяют определить практически любой интересующий антиген (рамки применения метода ограничиваются только име-ющеейся в распоряжении библиотекой антител).
Выявление связавшихся антител осуществляют с помощью ферментных или флуоресцентных меток. В клинической практике более распространены ферментные метки, поскольку метод иммунофлуоресценции, хотя
и является более чувствительным и специфичным, но требует дорогостоящего оборудования. К тому же, флуоресцентные красители имеют короткое время хранения. Некоторые методики включают применение полимерных носителей для антител, что увеличивает чувствительность реакции .
Конечным этапом столь трудоемкого и многоступенчатого исследования является идентификация белка при помощи баз данных (биоинформатика).
Биоинформатика с позиции прикладной науки позволяет не только хранить, анализировать и обрабатывать гигантские объемы данных, необходимые для проведения научных и диагностических процедур, но также способна обеспечивать получение информации о функциональных свойствах определенных белковых молекул на основании некоторых данных по структуре генома. Таким образом, не имея практически никакой информации по взаимодействию групп молекул между собой, их функциям и свойствам, в некоторых случаях можно достоверно, с высокой степенью вероятности, определить характеристики изучаемого объекта.
Протеомика как фундамент для научных исследований с последующим внедрением результатов в клиническую практику в рамках принципов и задач трансляционной медицины
В исследованиях нередко необходим анализ большого числа однотипных образцов. Между тем каждое исследование требует материальных и временных затрат, минимизировать которые позволяет метод тканевых матриц, подразумевающий создание библиотек образцов тканей с последующей возможностью одновременного (на одном стекле) исследования множества срезов . Типовая последовательность операций при исследованиях такого рода, такова:
Отбор образца (клетки, ткань, биологическая жидкость);
Приготовление образца (лизис клеток, экстракция белков);
Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле;
Проявление белковых пятен на геле;
Анализ электрофореграммы (число пятен, их расположение);
Выделение участков геля, содержащих индивидуальные белковые пятна;
Расщепление индивидуальных белков (трипсиниза-ция) непосредственно в геле;
Масс-спектрометрический анализ (определение аминокислотных последовательностей фрагментов индивидуальных белков);
Идентификация каждого белка и измерение его концентрации, документирование, обработка результатов;
Интерпретация полученных данных с помощью методов биоинформатики - анализ баз данных, получение дифференциального профиля белков.
С помощью такой процедуры уже открыты новые белковые маркеры и получены впечатляющие результаты в области кардиоваскулярной протеомики и онкопроте-омики.
Частные аспекты протеомики
Двумя основными разновидностями протеомики являются структурная и функциональная. Первая изучает
НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ
структуру индивидуальных белков, в то время как вторая рассматривает их во взаимодействии с другими белками, исследует происходящие при этом конформационные, биохимические и функциональные изменения. Совокупность всех белков клетки, взаимодействующих с конкретной белковой молекулой-мишенью, носит название «интерактом».
Первичным диагностическим целям служит прежде всего структурная протеомика, в то время как функциональная является в большей степени стезей научных исследований, а также фундаментом для разработок принципиально новых лекарственных средств, работающих с конкретными и индивидуальными фармакотерапевтическими мишенями клеточного и молекулярного уровня.
Протеомика плазмы крови
Среди всех тканей организма плазма крови в наибольшей степени отражает белковый состав: протеом плазмы включает около 1/10 всех присутствующих в организме белков. Среди присутствующих в плазме белков выделяют:
Белки, функционирующие в плазме;
Иммуноглобулины;
Гормоны;
Цитокины;
Транзиторно проходящие через плазму белки;
Внутриклеточные белки, попадающие в плазму при
разрушении или повышении проницаемости клеток;
Белки, отсутствующие в норме и секретируемые малигнизированными клетками;
Чужеродные белки .
Не меньше 1/2 белков плазмы существует в виде мультипротеиновых комплексов. С помощью особых молекулярных меток, вводимых в молекулу белка, возможны выделение и изоляция таких комплексов в целях их дальнейшего исследования на предмет особенностей конкретного интерактома.
К настоящему времени идентифицировано более 10 000 белков плазмы на основе масс-спектрометрического анализа одного или двух пептидов каждого белка и более 3000 белков - при идентификации двух и более пептидов. Почти 900 белков плазмы идентифицированы с достоверностью 95%.
Возможности, открываемые протеомным анализом плазмы крови, весьма заманчивы. Однако плазма как типовой тест-образец имеет и ряд существенных недостатков. К таковым относится очень большой (до 10 порядков) разброс концентраций белков и преобладание среди них диагностически мало значимых. При изучении изменений протеома плазмы, например при сердечнососудистой патологии, сначала нужно найти способ отделить эти незначимые белки, что представляет значительную трудность. Следовательно, оптимальным по чувствительности и специфичности будет исследование образца, полученного при биопсии органа-мишени, что, однако, не всегда применимо.
Следует отметить, что, несмотря на интенсивные исследования в данной области, темпы внедрения новых биомаркеров в клиническую практику остаются низкими . Это объясняется как объективными, так и субъективными причинами. Одной из них следует считать преимущественно эмпирический подход к организации исследований без их должного теоретического обоснования, а также недостаточное развитие инфраструктурных связей между исследовательскими центрами, отсутствие унифицированной номенклатуры и проблемы с систематизацией имеющихся данных. Фактические данные в немалой
мере остаются разрозненными, поскольку темпы их накопления опережают возможности науки к их интеграции.
Кардиоваскулярная протеомика
Этот раздел протеомики относится к развивающимся наиболее интенсивно. Уже созданы базы данных по сотням белков протеома миокарда, уровни которых изменяются при хронических и острых сердечно-сосудистых патологиях. Наибольшие успехи достигнуты в изучении дилатационной кардиомиопатии. При этом заболевании изменяется содержание более 100 белков, которые можно разделить на 3 основные группы:
Белки, связанные с энергией и метаболизмом;
Белки, индуцируемые стрессом;
Белки, обеспечивающие контрактильные функции
и формирование цитосклета.
Такие результаты вполне соответствуют современным представлениям о патогенезе дилатационной кардиомиопатии.
Не столь значительны успехи в изучении патогенеза ишемической болезни сердца и хронической сердечной недостаточности. Не всегда имеется возможность адекватно моделировать приведенные виды патологии: некоторые результаты, получаемые на животных моделях, не согласуются с таковыми на человеке. Большая часть достоверных результатов связана с ролью в развитии и предотвращении ишемической болезни сердца и хронической сердечной недостаточности т.н. белков теплового шока (Hsp 27) . Особое внимание уделяют изучению протеома при реперфузионном синдроме. После реперфузионной травмы обнаруживают изменения структуры сократительных белков: MLC-2 (легкая цепь миозина 2), всех трех белков тропонинового комплекса. Исследуют сигнальные механизмы, задействованные в патогенезе реперфузионного синдрома, хотя целостная картина белковых взаимодействий до конца все еще не установлена. Проводились исследования по изучению феномена дистантного прекондиционирования миокарда перед ишемической травмой, когда гипоксическое состояние создают сначала в каком-либо ином органе, а затем в сердце. При этом уменьшается реперфузионное повреждение. Однако до настоящего времени выявить кандидатные молекулы на роль гуморальных медиаторов прекондиционирования не удалось.
Изучение протеомики атеросклероза затруднено вследствие значительной функциональной гетерогенности фенотипа эндотелиальной ткани. Тем не менее, получены модели белкового профиля атеросклеротических бляшек, в которых обнаруживают изменения содержания таких белков, как Hsp27, кристаллинов, фактора некроза опухолей а, катепсинов, пероксиредоксинов и др., всего около 80 белков . Для создания биомаркеров атеросклероза предлагается исследовать профили белков плазмы, связанных с воспалением. Также изучается секреция белков атеросклеротическими бляшками in vitro.
При хронической сердечной недостаточности единственным клинически приемлемым биомаркером является В-натрийуретический пептид. Что касается ишемической болезни сердца, то здесь число биомаркеров значительно больше: сердечные тропонины, креатинкиназа и др. Однако их содержание повышается лишь на поздних стадиях ишемии, поэтому ведется поиск новых биомаркеров, позволяющих диагностировать ее ранние стадии. Другая область интересов - биомаркеры, специфичные именно для ишемии (а не некроза миокарда). На данный момент существует только один такой маркер - модифицированный ишемией альбумин (ischemic-
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 1
modified albumin, IMA). Тем не менее, невысокая специфичность затрудняет его использование вне комплекса с традиционными биомаркерами.
Исследование протеома сердца сопряжено со значительными трудностями. Наиболее точным методом анализа могла бы стать биопсия, но она трудновыполнима. В случае же исследования плазмы крови выделение среди огромной массы белков тех, которые могли бы иметь клиническое значение, представляет собой чрезвычайно непростую задачу. В связи с этим в исследованиях на животных нередко используют перфузию изолированных сердец кровезамещающими растворами с последующим исследованием выделенных тканями в раствор белков. Другим направлением является исследование перикардиальной жидкости. Так, у пациентов, которым проводилось кардиохирургическое вмешательство, исследовали уровень в перикардиальной жидкости белка H-FABP (белок, связывающий жирные кислоты, сердечный тип). Было обнаружено, что при ишемии уровень этого отсутствующего в плазме крови белка перикардиальной жидкости повышается .
Протеомика заболеваний легких
При исследованиях заболеваний легких, с точки зрения протеомики, в качестве образцов используют легочную ткань, жидкость, выстилающую эпителий, альвеоло-циты, плазму крови.
Для изучения протеома жидкости, выстилающей эпителий, в качестве образца применяют бронхоальвеолярную жидкость. Некоторые специфичные для легочной ткани белки, такие как глутатион^-трансфераза и белок сурфактанта B, представлены в этой жидкости значительно больше, чем в плазме. Исследуют изменения бронхоальвеолярной жидкости при различных заболеваниях: саркоидозе, муковисцидозе, мезотелиоме, идиопатическом фиброзирующем альвеолите и др. Исследование бронхоальвеолярной жидкости также позволяет выделять альвеолярные макрофаги для последующей оценки их протеомного профиля .
Для получения образцов легочной ткани необходимо использование инвазивных технологий. Эти исследования в основном направлены на оценку изменений протеома при раке легкого. В исследовании D.P. Carbone обнаружено, что содержание белков SUMO-2 (малый убиквитинопо-добный белок-2), тимозина-р4 и убиквитина коррелирует с прогнозом при немелкоклеточном раке легкого. Проводились исследования для определения белковых паттернов, отличающих инвазивные опухоли от нормального эпителия бронхов . Для повышения достоверности результатов при получении образцов использовали лазерную микродиссекцию с целью предотвращения захвата здоровых тканей. Тем не менее, прежде чем станет возможным внедрение новых биомаркеров в клиническую практику, потребуются длительные клинические испытания.
Для построения протеомных профилей аденокарцином также применяют исследование плазмы крови. Так, при мечении радиоактивным кислородом было обнаружено 211 белков, уровень которых при аденокарциноме легкого у мышей повышался, и 246 белков, содержание которых снижалось.
Онкопротеомика
Основные задачи онкопротеомики таковы:
Построение протеомов и анализ их динамики при возникновении и развитии различных опухолей;
Идентификация путей передачи клеточных сигналов, приводящих к онкогенезу;
Идентификация маркеров для диагностики онкологических заболеваний и для мониторинга ответа опухоли и организма на хирургическое вмешательство и на разные типы терапии;
Определение иммунного ответа на онкогенез. Онкомаркеры - макромолекулы (обычно белки
с липидным или углеводным компонентом), наличие и концентрации которых в плазме крови и/или другой биологической жидкости коррелируют в определенной степени с наличием и ростом злокачественной опухоли. Среди большого разнообразия показателей, использующихся в диагностике опухолей, есть как специфические онкомаркеры, так и некоторые вещества, концентрация которых может меняться при различных патологических процессах, в т.ч. и опухолевых. К наиболее специфичным онкомаркерам, практически отсутствующим в здоровом организме, относятся эмбриональные антигены (синтез которых прекращается на ранних стадиях эмбрионального развития и дерепрессируется при злокачественной трансформации): раковый эмбриональный антиген, а-фетопротеин. Опухоль-специфические антигены - молекулы (секреторные продукты или мембранные гликопротеины), экспрессируемые опухолевыми клетками более интенсивно, чем нормальными. К ним относятся СА 19-9, СА 15-3 (мембранные гликопротеины), а также простат-специфический антиген (ПСА) - секреторный продукт гландулоцитов простаты. Кроме того, в качестве онкомаркеров могут выступать гормоны (хорионический гонадотропин) и вещества других групп (тиреоглобулин, Р2-микроглобулин и др.) . Для прогнозирования течения заболевания исследуют белки-маркеры пролиферативной активности и белки-регуляторы апоптоза (рис. 1).
Области клинического применения онкомаркеров следующие:
Ранняя диагностика онкологических заболеваний;
Мониторинг и оценка эффективности лечения;
Определение прогноза.
Исходя из вышесказанного, основными требованиями к онкомаркеру являются достаточно высокая чувствительность и специфичность, корреляция с объемом опухоли, способность давать информацию о локализации опухоли.
Чувствительность и специфичность большинства доступных в настоящее время опухолевых биомаркеров часто оказывается недостаточной. Клинически пригодными считают маркеры, для которых чувствительность при специфичности 95% составляет более 50%, и лишь немногие из них при указанном уровне специфичности способны демонстрировать чувствительность более 70%. Существует 2 подхода к поиску новых онкомаркеров: первый предполагает направленные исследования на основе современных знаний о канцерогенезе, проверку определенных гипотез; второй - эмпирический поиск путем сравнения протеомов нормальных и опухолевых клеток либо путем сравнения белкового профиля сывороток здоровых и больных пациентов, пациентов; имеющих и не имеющих факторы риска.
Рассмотрим возможности применения современных онкомаркеров в 3 указанных выше аспектах.
1. Диагностика. Ввиду недостаточной чувствительности большинство онкомаркеров непригодно для скрининговых исследований в общей популяции. Однако некоторые из них могут эффективно применяться для ранней диагностики в группах риска, где вероятность заболевания изначально выше. Так, скрининг на ПСА
НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ
Анализ экспрессии генов
Белковые
микрочипы
Масс-спектрометрия
Автоматизированный
ИГХ-профили
А____________
Оценка прогноза Выбор метода лечения Получение новых антител
Иммуногистохимические (ИГХ) методики
Сыворотка
Непрямые методы
Мониторинг лечения
Л_________
Выбор метода лечения Мониторинг эффективности лечения выявление побочных эффектов
Базы данных
Прямые методы
Диагностика
К___________
Рання диагностика в группах риска Диагностика рецедивов
Рис. Технологии протеомики в диагностике онкологических заболеваний.
осуществляют в группе мужчин старше 50 лет; скрининг на а-фетопротеин (маркер гепатоцеллюлярной карциномы) - у больных циррозом печени; на кальцитонин (маркер медуллярного рака щитовидной железы) - у лиц с отягощенным наследственным анамнезом.
2. Мониторинг течения заболевания. В настоящее время именно для этих целей онкомаркеры применяют наиболее широко. Признаком успешной радикальной операции является стойкое снижение концентрации маркера. Последующее ее повышение свидетельствует, в зависимости от времени и скорости нарастания, о наличии резидуальной опухоли, возникновении рецидива или отделенном метастазировании.
3. Прогнозирование течения заболевания и определение лечебной тактики. Уровень многих онкомаркеров коррелирует с объемом первичной опухоли и резко возрастает при местном и отдаленном метастазировании. Так, к примеру, при хроническом лимфолейкозе содержание маркера сывороточной дезокситимидинсинтетазы коррелирует с вариантом течения заболевания (стабильным или прогрессирующим) .
Для прогнозирования течения заболевания определяют также экспрессию маркеров пролиферативной активности: белка Ki-67, PCNA, циклинов (например, циклина D1), ингибиторов циклин-зависимых киназ. Большое прогностическое значение имеют уровни белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-x, Bax, Bak и др.) . В последнее время интенсивно исследуют ингибиторы апоптоза - сервивин, теломеразу. Повышение концентрации этих молекул было продемонстрировано для опухолей многих, хотя и не всех локализаций. При этом уровень их экспрессии коррелирует со стадией развития опухоли. Для карцином некоторых типов доказана корреляция течения с уровнем экпрессии белка р53, а также числом мутантных форм этого белка .
Тип исследуемого маркера и значимость результата варьируют в зависимости от гистологического строения и локализации опухоли. Окончательное заключение выносится после комплексной оценки с другими факторами. Важной задачей онкологии является идентификация сигнальных путей, вовлеченных в процесс канцерогенеза. Несомненна роль в этом процессе белков-регуляторов апоптоза: р53, белков семейства bcr и др. . В фокусе функциональной протеомики находится изучение инте-рактомов указанных белков, иными словами - реконструкция молекулярных взаимодействий, в которые эти белки вовлечены.
Основная проблема во внедрении онкопротеомики в практику состоит в сложности обучения онкологов чтению карт онкотранскриптомов и онкопротеомов.
Виды белковых молекул и особенности интерактомов
Хотя многие белки осуществляют свои функции независимо, подавляющее большинство из них требует высокоспецифичных взаимодействий с другими белками организма для проявления своей биологической активности. Примеры различных белок-белковых взаимодействий, встречающихся в сложных биологических системах:
Белок-белковые интерактомы в строго определенных клеточных компартментах;
Белки-мессенджеры, взаимодействующие с рецепторами на внешней поверхности клеточной мембраны, что является необходимым условием для запуска сигнальных каскадов;
Белки, формирующие сетевые и структурные взаимодействия, структурные взаимосвязи на межклеточном уровне;
Ингибиторы ферментов;
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 1
Модификация (часто с последующей денатурацией) в результате действия ферментов;
Взаимодействия белковых субъединиц, приводящих к аллостерическим эффектам в составе мультимерных биокомплексов;
Белок-белковые взаимодействия, лежащие в основе двигательных функций отдельных органелл, органов или организма в целом (мышечное сокращение). Белковые взаимодействия обычно подразделяют
на стабильные и транзиторные, причем оба типа могут обеспечиваться как сильными, так и слабыми межмолекулярными связями .
Стабильное взаимодействие наблюдается в белках, состоящих из нескольких субъединиц-комплексов, полипептидных цепей. Типичным примером комплексных белковых молекул, состоящих из нескольких стабильно связанных полипептидных цепей, могут служить гемоглобин и полимеразы.
Транзиторные белок-белковые взаимодействия участвуют в контроле большинстви внутри- и внеклеточных сигнальных процессов. Транзиторные взаимодействия обычно требуют определенного набори условий, который способствует развитию различных физиологических эффектов, а именно: фосфорилирования, конформацион-ных изменений или локализации на дискретной области 70 клетки. Временно взаимодействующие белки вовлечены в широкий спектр клеточных процессов, в т.ч. в каталитическую модификацию белка, транспортную, резервную, сигнальную, регуляторную, рецепторную и моторную функции.
Транзиторное белок-белковое взаимодействие наблюдается и при транспорте белков через поры мембраны, при деформации нативных белков, на отдельных этапах цикла трансляции, переформировании клеточных структур в ходе клеточного цикла (цитоплазматические микро-филаменты, комплекс ядерных пор и др.) .
Белки могут связываться друг с другом с помощью гидрофобных/гидрофильных связей, Ван-дер-ваальсовых сил, ионных мостов между связывающими доменами на каждом белке. Эти домены могут быть представлены небольшим участком поверхности белка и состоять всего лишь из нескольких пептидов. С другой стороны, широко распространены белки с длинными полипептидными участками, охватывающими сотни аминокислот; прочность их связывания зависит от размера и свойств связывающего домена. Одной из самых распространенных внутрибелковых связей, обеспечивающей стабильность всей молекулы, является лейциновая «застежка-молния».
В лейциновой «застежке» аминокислота лейцин находится приблизительно в каждом 8-м положении а-спирали, в результате чего лейциновые остатки оказываются на одной ее стороне, образуя амфипатическую спираль, в которой одна сторона обладает гидрофобными свойствами. Таким образом, лейциновая «застежка» образует димерный белок благодаря связыванию двух параллельных а-спиралей подобно застежке-молнии.
Два Src-гомологичных (SH) домена, SH2 и SH3, являются примером временного связывания доменов, которые соединяются короткими пептидными последовательностями и обычно встречаются в сигнальных белках. Sffi-домен «признает» только пептидные последовательности с фосфорилированными остатками тирозина, что является признаком активированного белка. Другими словами, область SH2 - наиболее важная на рецепторе, участвующем в сигнальном пути фактора роста, в котором с помощью лиганд-рецептор-опосредован-ного фосфорилирования остатков тирозина с помощью Sffi-доменов распознаются эти остатки. SH3-домены обычно распознают богатые пролином последовательности пептидов и, как правило, встречаются в таких ферментах, как киназы, фосфолипазы и ГТФазы. Они предназначены для выявления целевых белков .
Заключение
Протеомика, будучи наукой фундаментальной, тем не менее, незаменима при решении ряда практических медицинских и прикладных научных задач. Исследование различных биологических жидкостей организма с применением современных технологических приемов проте-омики может предоставить врачу-диагносту достаточные объемы информации, необходимые для однозначной постановки диагноза либо оценки рисков определенного заболевания у конкретного пациента. Построение алгоритмов доклинического и клинического мониторинга больных с использованием конгломератов лабораторно-диагностических процедур, включающих геномные, транскриптомные и протеомные методы анализа, а также биоинформационные приемы обработки и анализа данных, является залогом успешного выявления патологического состояния в стадии скрытого течения, верификации диагноза, определения и возможной предикции типа и характера течения болезни, а также мониторинга реакций организма пациента в ответ на применяемый вид терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Alaoui-Jamali M.A., Xu Y.J. Proteomic technology for biomarker profiling in cancer: an update. J. Zhejiang. Univ. Sci. B. 2006; 6: 411-420.
2. Введение в молекулярную диагностику. Под ред. М.С. Пальцева. М.: Медицина. 2010. 368 с.
3. Anderson N.L., Anderson N.G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. CellProteomics. 2002; 11: 845-867.
4. Sturgeon C. Perspectives in clinical proteomics conference: translating clinical proteomics into clinical practice. Exp. Rev. Proteomics. 2010; 4: 469-471.
5. McGregor E., Dunn M.J. Proteomics of heart disease. Hum. Mol. Genet. 2003; 2: 135-144.
6. Edwards A.V, White M.Y., Cordwell S.J. The role of pro-teomics in clinical cardiovascular biomarker discovery. Mol. Cell Pro-teomics. 2008; 10: 1824-1837.
7. Bowler R.P, Ellison M.C., Reisdorph N. Proteomics in pulmonary medicine. Chest. 2006; 2: 567-574.
Итак, главной задачей протеомики является выявление механизма взаимодействия огромного числа белков и пептидов в одном организме. Какова же практическая значимость этой грандиозной и дорогостоящей работы? Очевидно, что в первую очередь в результатах такой работы заинтересованы фармакологи и медики, поскольку очень часто прослеживается тесная связь между изменениями в белковом составе и болезненным состоянием человека. Поэтому новые данные в протеомике будут использоваться (и уже используются) для быстрой разработки новых лекарственных средств и новейших методов лечения болезней, с которыми медицина боролась веками. На сегодняшний день 95% всех фармакологических средств воздействуют на белки. Протеомика со своим системным подходом может помочь идентифицировать и оценить важность появления новых белков гораздо эффективнее, что, в свою очередь, ускорит разработку новых диагностических тестов и терапевтических средств.
Первое практическое применение протеомных исследований состоялось задолго до появления термина «протеомика», еще в начале XX в., когда была обнаружена роль инсулина в развитии такого тяжелого заболевания, как диабет. Создание инсулиновых препаратов спасло жизнь миллионам людей.
В настоящее же время протеомика, вместе с геномикой и биоинформатикой, ориентирована на создание новых лекарственных препаратов (рис. 18), в которых молекулярными мишенями будут служить те или иные белки . Процесс нахождения новых мишеней для действия лекарств решается с помощью биоинформатики, причем объектом анализа является геном. Однако после анализа генома необходимо получить доказательства того, что данный белок интенсивно экспрессируется и находится в клетке в рабочем состоянии. Эту задачу решает протеомика. Таким образом выявляется молекулярная генетическая мишень для лекарства.
Следует отметить, что протеомика может и сама по себе решать проблему нахождения мишени. Если получить протеомные карты (подобные тем, что представлены на рис. 3 или 4) нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики. Можно предположить, что в будущем к обычному анализу крови добавится создание протеомных карт крови. Для этого в поликлиниках необходимо будет использовать специальное оборудование, с помощью которого у пациентов периодически будут брать кровь. При возникновении болезненного состояния протеомную карту больного человека нужно будет всего лишь сравнить с его же протеомной картой, но составленной в то время, когда он был здоров, и можно будет выявить произошедшие изменения в белковом составе крови и определить причину заболевания. Подобное сравнение протеомов опухолевых и нормальных клеток, клеток до и после воздействия определенных факторов (например, физических или химических), использование биологических жидкостей в диагностических целях – все это представляет огромный интерес и открывает совершенно новые перспективы для медицины, ветеринарии, фармакологии, пищевой промышленности и других прикладных областей. Впереди предстоит огромная и интересная работа.
Библиография
1.Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. et al. Nucliotide sequence of bacteriophage phi X-174 DNA.//Nature. 1977. V. 265, № 5596. P. 687–695.
2.Fleischmann R.D., Adams M.D., White O. et al. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd.//Science. 1995. V. 269, № 5223. P. 496–512.
3.Nature. 2001. 409, № 6822 (большая часть выпуска журнала посвящена расшифровке генома человека).
4.Ferguson-Smith A.C., Ruddle F.H. The genomics of human homeobox-containing loci.//Pathol. Immunopathol. Res. 1988. V. 7, № 1–2. P. 119–126.
5.Franklin J. Bioinformatics changing the face of information.//Ann. NY Acad. Sci. 1993. V. 700. P. 145–152.
6.Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.//Electrophoresis. 1995. V. 16, № 7. P. 1090–1094.
7.Замятнин А.А. Блистающий мир белков и пептидов.//Биология. 2002. № 25–26. P. 8–13.
8.Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.//Proteomics. 2004. V. 4, № 12. P. 3665–3685.
9.Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturized proteomics and peptidomics using capillary liquid separation and high resolution mass spectrometry.//FEBS Lett. 2004. V. 567, № 1. P. 92–95.
10. http://au.expasy.org/sprot/
11 http://erop.inbi.ras.ru/
12. Малыгин А.Г. Метаболизм карбоновых кислот (периодическая схема). – М.: «Международная программа образования», 1999.
13. Арчаков А.И. Что за геномикой? – Протеомика.//Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46, № 4. С. 335–343.
14. ru.wikipedia.org/wiki/Протеомика
15. www.biomed.spbu.ru/equipment/proteomics/
16. thesaurus.rusnano.com/wiki/article1579
17. www.inbi.ras.ru/ubkh/49/Terentiev.pdf
18. www.strf.ru/material.aspx?CatalogId=352&d_no=11979
19. www.textronica.com/lcline/proteomics/proteomics.html
20. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf
21. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf
протеомика исследование фермент
В настоящее время происходит революция в представлениях об этиологии, патогенезе и терапии болезней человека, что связано с достижениями в области молекулярной биологии и генетики, молекулярной медицины и фармакологии .
Достигнуты серьезные успехи в понимании структуры и функции ДНК, РНК, белков, репликации и функционировании генома, обратной транскрипции, модификации, репарации и рекомбинации ДНК, транскрипции и трансляции мРНК в клетках про- и эукариот. Многочисленные исследования на основе новых биоаналитических методов прояснили основные пути регуляции экспрессии генов. Подробно изучены технологии рекомбинантных ДНК. Мощное развитие в настоящее время получило изучение физико-химических основ развития наследственных и социально-значимых болезней человека (атеросклероз, онкопатологии, сахарный диабет, внутриклеточные инфекции, нейродегенеративные болезни и т.д.).
В постгеномную эру остро встает вопрос о практической реализации фундаментальных разработок в области молекулярной биологии, медицины и фармакологии. При этом отражением функционирования генома являются постгеномные события, связанные с синтезом многочисленных белков, исследованию которых сейчас уделяется особое внимание в рамках отдельного научного направления - протеомики. Развитие протеомных исследований невозможно без построения алгоритмов и методов анализа, создания базы данных, позволяющих выяснять механизм функционирования биологических текстов и разрабатывать целенаправленные фармакологические воздействия (биотрансформатика).
Связанные проблемы геномики и протеомики, фармакогеномики и биотрансформатики реализуются на основе уникальных методологических решений и технологических платформ.
В настоящее время на уровне академических центров, различных НИИ России, стран СНГ, Западной Европы, США и Канады развиваются и внедряются в клинику результаты работы научных технологических платформ для биомедицинских и фармацевтических исследований.
Цель практики - изучить основы протеомики и протеомного картирования
Задача практики - закрепление и углубление теоретических знаний, полученных в процессе обучения; освоить методы работы со специальной литературой; собрать конкретные материалы в соответствии с рекомендованными вопросами; оформить результаты, полученные в ходе прохождение практики.
Начало XXI века ознаменовано началом эры протеомики. Термин этот происходит от двух других хорошо известных в биохимии понятий: «PROTEins» и «genОМe» и впервые был использован в 1995 г. .
Конечно, геномика не исчезнет, она будет развиваться с той же самой, а может даже большей скоростью, но ясно, что центр постгеномных исследований будет перенесен в область инвентаризации и выяснения протеомной карты человека. На первый взгляд, задача кажется совершенно не решаемой. Если геномная карта человека одинакова, по сути дела, для всех клеток человека (это 23 хромосомы с одним и тем же набором генов - исключение составляют 14 половые клетки), то в случае протеомной карты человека говорить об общности ее совершенно бессмысленно: каждая клетка, каждая ткань, каждая биологическая жидкость должна иметь собственную протеомную карту. Несмотря на то, что в каждой клетке может быть около 100 000 функционирующих генов, многочисленные реакции модификации могут увеличить число белков в клетке до 10 - 20 миллионов .
В этой связи в настоящее время существует два определения протеомики: узкое, которое можно назвать структурной протеомикой, и более широкое, которое включает и структурную, и функциональную части протеомики. В узком смысле этого слова протеомикой является наука, занимающаяся инвентаризацией белков с помощью комбинированного использования методов: двумерного электрофореза (2D-электрофорез), масс-спектрометрического (МС) анализа молекулярной массы и последовательности разделенных электрофорезом белков биологического материала с последующим анализом полученных результатов методами биоинформатики. По сути дела, структурная протеомика - это комбинация 2D-электрофореза, масс-спектрометрии и биоинформатики. И если разрешающие возможности двумерного электрофореза известны давно, с первой работы O"Farrell в 1975 г., то возможности МС анализа очень быстро определять молекулярную массу и последовательность полипептидных цепей стали ясны только в самое последнее время. Развивались они настолько быстро, что сейчас некоторыми фирмами созданы уже полностью автоматизированные системы для определения молекулярной массы и последовательности белков, работающие на фентомолярном и атомомолярном уровнях концентрации . С помощью комбинации этих методов можно создать протеомную карту любого биологического материала, которая представляет собой фенотипическое проявление генома клетки, ткани или даже целого органа. В более широком смысле термины протеомный анализ, или протеомика могут быть использованы не только для инвентаризации белков биологического объекта, но и для контроля обратимой посттрансляционной модификации (ПТМ) белков специфическими ферментами, как-то: фосфорилирование, гликозилирование, ацилирование, френилирование, сцльфирование и т.д. .
В настоящее время уже более 300 различных типов посттрансляционной модификации охарактеризовано с помощью протеомики .
Интенсивное развитие МС-анализа способствовало появлению за последние 5 - 7 лет целой группы направлений протеомных исследований (рис. 1), большая часть которых имеет биомедицинскую направленность, однако, фундаментальная основа на сегодняшний день, по-прежнему, сохраняется за структурной и функциональной протеомикой.
Политика большинства стран Евросоюза, России и стран СНГ в той или иной степени связана с естественным стремлением населения жить в соответствии с мировыми стандартами качества. Такие термины как «экологически чистый район» или «экологически чистый продукт», а также всевозможные слова с приставкой «евро-», прочно вошедшие в обиход, к сожалению, в большинстве случаев, не имеют фактического пополнения. Вместе с тем, желанные стандарты качества жизни, установленные во многих странах, являются результатом протекания сложных процессов, затрагивающих культурные, социальные и правовые аспекты развития этих государств.
Рисунок 1 - Современные направления протеомного анализа.
Методическое пособие
Протеомные исследования в биологии и медицине
План:
Введение
Протеомика в биологии
Протеомика в медицине
Заключение, перспективы
Термин «протеом», обозначает весь белковый комплемент, экспрессируемый геномом – “PROTEOME: entire PROTEin complement expressed by genOME”. Протеомика – это системное изучение «протеома», то есть всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме). Высокая значимость каждого из индивидуальных белков для обеспечения тех или иных функций и/или молекулярных структур в организме не только определяет их вовлеченность в различные физиологические и патологические процессы с потенциальными возможностями для использования белков в качестве эффективных диагностических маркеров, но и для применения некоторых белков как лекарственных средств. Для обнаружения и исследований новых белков широко применяются новые технологии , которые после завершения международного проекта «Геном человека» принято называть постгеномными. В частности, для системных исследований информационных РНК (транскриптов) используют термин «транскриптомика», а для системных исследований белков – «протеомика». Освоение и использование геномных и постгеномных технологий позволяет вывести молекулярно-биологические исследования, направленные на решение медицинских вопросов, на качественно более высокий уровень.
Традиционные подходы к изучению индивидуальных белков – биохимический и иммунохимический ориентируются на последовательное изучение отдельных белков. Для достижения цели белки изучают (выделяют), используя их индивидуальные свойства – функциональную активность или антигенность . В тоже время, системный подход ориентируется на параллельное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему, что характеризует исследуемый объект в целом. Рисунок 1 демонстрирует различие в разрешающей способности между одномерным электрофорезом (разделение смеси белков по разнице в их молекулярных массах) и комплексным методом – двумерным электрофорезом. Двумерный электрофорез в состоянии выявить в несколько раз больше индивидуальных белков, по сравнению с одномерным.
53" height="32" style="vertical-align:top">
Рис. 1. Сравнение результатов одномерного (А) и двумерного (Б) форезов мембранных белков эритроцитов человека. Результат: одномерный форез выявил около 30, а двумерный – 189 белков.
В 20 веке методы аналитической химии прогрессировали от простых процедур, имеющих дело с единичными элементами, к более сложным методам, основанным на физическом разделении и детекции веществ. Таким образом, уже более 50 лет назад большое внимание уделялось методам разделения частиц – хроматографии, электрофорезу, масс-спектрометрии. Несколько позднее изобрели капиллярный электрофорез (гг.). Из всех этих методов только масс-спектрометрия обеспечивала разрешение, достаточное для разделения и идентификации сложных элементных смесей, однако до недавнего времени, и она не могла адекватно разделять макромолекулы. Задавшись целью увеличить разделительную способность, ученые пришли к выводу о необходимости совместить в двух измерениях два каких-либо метода, основанных на измерении разных параметров. Изначально предлагалось использовать два различных растворителя при разделении молекул в процессе хроматографии на бумаге, а также предпринимались попытки совместить электрофорез, в качестве первого направления с хроматографией, в качестве другого. Эта же концепция также имела место при разделении молекул по седиментационным коэффициентам и по различиям в плотности при ультрацентрифугировании. Если два метода разделения независимы друг от друга, то финальное разрешение должно определяться суммой разрешения обоих методов. В принципе, можно было бы добавить более двух измерений, однако такой подход может привести к значительному падению концентрации исследуемого вещества и к возникновению проблем в детекции сигнала.
По крайней мере шесть независимых попыток разработать двумерный электрофоретический метод было предпринято, прежде чем в 1975-76 гг. была опубликована первая доступная весия метода, объединяющая изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в растворах мочевины с электрофорезом в присутствии йонного детергента додецилсульфата Na (SDS). Разделение проводилось по первому направлению на основе заряда денатурированных белков (зависит от аминокислотной последовательности), а по второму направлению – в зависимости от молекулярной массы (см. раздел Методы).
В течение прошедших с тех пор 30 лет метод подвергался многим дополнениям, в частности, была предложена идентификация разделенных белков с помощью микросеквенирования и масс спектрометрии. Создаются компьютерные базы данных , содержащие сведения о клетках в культуре, белках плазмы крови, белках печени мыши и крысы, E. Coli, дрожжей и других модельных объектах. Практическое расширение области используемых pH связано с использованием коммерческих наборов иммобилинов, то есть иммобилизованных на специальных стрипах амфолинов. Использование таких наборов увеличивает воспроизводимость и увеличивает область действия метода. Иммобилиновая система позволяет использовать значительные нагрузки по белку: 1-10 мг на полоску (обычная нагрузка составляет около 100 мкг белка) и обеспечивает возможность изучения белков с рН > 8,5.
2Д электрофорез заложил основу для расшифровки молекулярного строения человеческих и животных тканей, клеток, бактерий и вирусов и для детектции изменений, происходящих при развитии, старении, заболеваниях а также в ответ на изменения окружающей среды. Протеомные методы используются для определения маркеров заболеваний и разработки новых лекарств. Также комбинация 2Д электрофореза с фракционированием клеточных органелл может дать информацию о внутриклеточной локализации специфических белков. Метод должен отличаться воспроизводимостью и возможностью количественной оценки результатов. В идеальном случае, должна быть возможность автоматизации всего набора процедур. До сих пор не существует полностью автоматизированного 2Д электрофореза, в связи с тем, что процедуры, входящие в него очень трудоемки.
Интересный аспект истории 2Д электрофореза показан на рис. 2, представляюшем число публикаций, найденных по запросу: 2Д электрофорез и протеомика. В последние 10 лет число статей, посвященных 2Д электрофорезу стабилизировалось и вышло на плато. С чем это связано - с тем, что 2Д электрофорез выходит из моды? Или это объясняется теми успехами секвенирования генома, которые наблюдаются в последние годы? Однако, даже если представить себе полностью расшифрованные геномы всех без исключения живых существ, протеомика будет иметь право на существование, так как связывает продукты деятельности генов с функциями организма. В последние несколько лет термин «протеомика» очень часто встречается среди цитируемых статей (рис. 2)
Рис. 2. Число публикаций, посвященных 2Д электрофорезу (2D or two D ) и протеомике (proteom *) в базе данных MEDLINE c 1975 по 2005 гг.
Эпигенетическая система отражает взаимодействие организма с окружающей средой, а также взаимодействия между генами и продуктами их деятеьности. Эти взаимодействия могут быть прямыми (рис. 3) или осуществляться посредством сложной сети взаимодействий на белковом уровне (рис. 4) В последнем случае, наличие дефекта в гене может приводить или не приводить к заболеванию; кроме этого, степень и тяжесть заболевания может изменяться в зависимости от индивидуума. В эти сложные взаимодействия также включается воздействия окружающей среды на организм.
https://pandia.ru/text/78/543/images/image006_30.jpg" width="377" height="337 src=">
Рис. 4. Схематическое изображение системы в которой между генотипом и фенотипом существуют комплексные взаимодействия на белковом уровне. Х –гипотетическое лекарственное средство; стрелки справа означают регуляторное воздействие лекарственного средства на фенотип (стрелка вверх – усиление экспрессии, стрелка вниз – подавление экспрессии специфические белки).
Известно, что только 2% болезней человека вызваны действием одного гена. Оставшиеся 98% заболеваний являются поли - или эпигенными по своей природе. Из этого утверждения следует то, что ни один ген не может действовать в одиночку. Он действует только в связи с другими генами а также с окружением. Гены могут экспрессироваться по-разному в разных организмах, а также ингибировать друг друга (явление, называемое эпистаз). Таким образом, для большинства полигенных заболеваний невозможно предсказать фенотип, исходя только из данных расшифровки генома.
Клетка реагирует на изменения внешней среды изменением ее белкового состава. В ответ на внешнее воздействие синтез одних белков увеличивается, других – уменьшается. Таким образом, фенотип не линейно зависит от проявлений генотипа, так как системы эпигенеза контролируют и модифицируют экспрессию генов. Практически все элементы эпигенетической системы – белки.
Молекулярный фенотип живой клетки невероятно лабилен. Многие белки имеют своей основной функцией перенос информации. Не существует фиксированного синтеза того или другого белка, поэтому концентрация белков в клетке изменяется. При обработке клетки гормонами, токсинами или лекарствами, количественные изменения наблюдаются не в одном, а в целом ряде белков. Существует два типа регуляции: up - и down-. Клетки – реактивные системы, в которых информация передается не только от генов к белкам, но и противоположном направлении (рис. 5).
https://pandia.ru/text/78/543/images/image009_22.jpg" width="378" height="378">Рис.5. Схема взаимодействия генома с окружающей средой.
Элиминация единичного белка в организме (например, в Knock-out мыши) приводит к изменению всего молекулярного фенотипа целого организма. Более того, любое лекарство, которое воздействует на белок, например, на ионный канал, опосредованно влияет на белковый состав всего организма.
Степень гликозилирования определяет биофизические свойства и биологическую активность молекулы белка. Гликозилирование – это посттрансляционная модификация, поэтому оно является основой гетерогенности белковой популяции. Попытки охарактеризовать гетерогенную популяцию гликозилированных белков предпринимались с использованием капиллярного электрофореза в тандеме с масс-спектрометрией.
В клинической биохимии анализ индивидуальных белков человека используется для установления вида патологического процесса (дистрофии, опухолевый рост, воспаление) и определения пораженного органа (инфаркт миокарда);
Установления природы патологии, например, при диагностике энзимопатий, инфекционных (гепатит) и других заболеваний;
Оценки течения различных физиологических процессов (беременность , развитие иммунной системы) и обнаружения осложнений в их течении (патология беременности).
В области разработки лекарств основной проблемой, как правило, является увеличение или уменьшение активности белков, поэтому необходим некоторый метод, позволяющий регулировать специфическую активность. 2Д электрофорез является основным средством изучения воздействия лекарств на протеом, или на совокупность всех белков органа. Как правило новые лекарства тестируются с помощью 2Д электрофореза, на накопление их в критических органах, например, в печени.
Пример 1. Лекарство ловастатин, понижающее уровень холестерола в крови. Специфика его действия заключается в ингибировании HMG-кофермент А редуктазы. Однако, при анализе эффекта, которое оказывает это лекарство в комбинации с другими средствами, понижающими холестерол, было найдено, что количество белка HMG-Кофермент-A синтазы значительно повышается, в то время как количество других белков уменьшаются. Позднее обнаружили, что основное действие изучаемого лекарства заключается не в прямом ингибировании синтеза холестерола, а в повышении активности другого белка, липопротеинового рецептора, который удаляет из крови холестерин.
Пример 2. Превентивное лекарство против рака олтипраз повышает экспрессию ряда белков, включая афлатоксин В1 альдегидредуктазу, который разрушает один из натуральных канцерогенов. Предполагалось, что эффект имеет место в эндоплазматическом ретикулуме. При анализе 2Д геля, однако, выяснилось, что большинство изменений происходит в растворимой и митохондриальной фракциях клетки. Кроме этого, при сравнении экстрактов печени самок и самцов, экспрессия более трети белков отличалась в количестве. Следует заметить, что почти все эти различия регулируются на гормональном эпигенетическом уровне и не обусловлены наличием Х или У хромосомы.
Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия генов в тканях очень пластична, отвечает на воздействия большого числа факторов и почти всегда включает не один или два, а много генов. 2Д электрофорез идеально подходит для изучения подобных динамических изменений.
Как правило, результаты 2Д коррелируют с известными механизмами функционирования белков. Так, если лекарство усиливает пролиферацию в пероксисомах по данным электронной микроскопии, то и на 2Д электрофорезе будет наблюдаться увеличение количества белков, характерных для этого типа органелл. Подобные структурно-функциональные взаимодействия означают, что идентификация белков-мишеней для нового лекарственного средства может помочь открыть механизмы функционирования этих белков.
Еще одна важная функция 2Д методов в клинической протеомике это поиск новых белков-маркеров заболеваний, в частности, онко-маркеров. Отмеченные в таблице 1 потенциальные маркеры рака простаты представляют особый интерес по разным причинам. Например, тимозин бета-15 может определяться в моче и, по-видимому, имеет прямое отношение к молекулярным механизмам злокачественного перерождения клеток. Соответственно, ген тимозина бета-15 и его продукты могут стать не только диагностическими маркерами, но и в перспективе мишенями для различных воздействий с целью подавления опухолевого роста.
Таблица 1.
Название маркера | Значимость для диагностики рака простаты (РП) |
1. Белок AGR2 (AGR2) | Секреторный белок, андроген-индуцируемый, обнаружен в РП, гиперэксперессия в 89% случаев РП. Обнаруживается при других опухолях |
2. Простат-специфический мембранный антиген | Маркер с прогностической значимостью. Высокий уровень коррелирует со злокачественностью и метастазированием, но определяется и при аденоме |
3. Тимозин бета 15 | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью «Мочевой» маркер, что перспективно при организации скрининга Обнаруживается при других злокачественных опухолях. |
4. Белок Р63 | |
5. Рацемаза (alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR) | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью. |
6. Антиген простатных стволовых клеток (Prostate stem cell antigen, PSCA) | Маркер клеточных поверхностей, показана гиперэкспрессия гена при РП до 80%; высок уровень экспрессии при метастазах РП |
7. Высокомолекулярный цитокератин 34betaE12 (High-molecular-weight keratin 34betaE12) | По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью. |
Комплексное изучение «протеома» проводится методами и технологиями, направленными на одновременное разделение, а также последующую идентификацию и анализ всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме).
1. Изоэлектрофокусированием (ИЭФ) называют разработанный в начале 60-х годов метод разделения белков под действием электрического поля в среде с градиентом pH, который создается специальными амфотерными веществами – «амфолитами», способными переносить ток (хорошая проводимость), а также создавать локально и поддерживать рН (хорошая буферная емкость). Появление наборов полиамино-поликарбоновых кислот (амфолинов) обеспечило высокую эффективность фракционирования белков с помощью ИЭФ, при этом разделение осуществлялось за счет различий в pI.
2. Среди множества электрофоретических методов разделения белков наибольшая эффективность оказалась у особой модификации метода Лэммли для вертикальных пластин с градиентом концентрации полиакриламидного геля, использующего ионный детергент – додецилсульфат Na (SDS). За счет гидрофобных взаимодействий, используемый детергент практически одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1.4 мг SDS на 1 мг белка. Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты делает несущественной роль заряда самого белка. Электрофоретическая подвижность комплекса белок-SDS в градиентном геле оказывается линейно связана с десятичным логарифмом его молекулярной массы (Mm). Таким образом, эта система обеспечивает разделение белков по различиям в Mm.
3. Идентификация миросеквенированием основана на определении (расшифровке) части аминокислотной последовательности белка. Разработанные методы микросеквенирования позволяют работать с очень малыми количествами пептидов - вплоть до нанограммовых. Это важно, так как определение даже короткого фрагмента аминокислотной последовательности часто оказывается решающим для идентификации целого белка. В настоящее время возможно как проведение прямого N-концевого секвенирования белка, перенесенного на инертную мемебрану, так и секвенирование отдельных пепетидов, полученных из изучаемого белка после его ферментативного расщепления высокоэффективной жидкостной хроматографией. Микросеквенирование позволяет выявлять одиночные аминокислотные замены в анализируеемых белках.
4. Масс-спектрометрия устанавливает какие атомы входят в состав молекулы, какова структура их расположения и изотопный состав, а также какова масса молекулы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет соотношение массы частицы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. Различают несколько модификаций масс-спектрометрических методов:
· Мягкая матриксная ионизация (M atrix-A ssisted L aser D esorption/I onization - MALDI) позволяет анализировать такие биополимеры, как полисахара, пептиды и макромолекулы, без риска повредить их структуру. Ионизация производится лазерным пучком, а матрикс используется для защиты молекул от разрушающего действия лазера. Матрикс состоит обычно из кристаллов кислот в смеси с органическим растворителем.
· Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) проводится на приборе, который объединяет несколько анализаторов, позволяющих последовательно изолировать один пептид, стабилизировать ионы, составляющие его и идентифицировать фрагменты. Используется в идентификации белковых пятен после 2Д электрофореза.
5. Капиллярный электрофорез - это метод анализа сложных смесей, использующий электрокинетические явления – электромиграцию ионов и других заряженных частиц и электроосмос – для разделения и определения компонентов. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты. Модификацией метода является капиллярный электрофорез в чипах. Идентификация белков с помощью масс-спектрометрии может проводиться непосредственно после разделения.
6. Недавно был аннонсирован метод капиллярного изоэлектрофокусирования. После изофокусирования в канале чипа, покрытого специальной пленкой, чип замораживался, пленка удалялась и содержимое канала подвергалось высушиванию при критической точке для предотвращения изменения позиции белковых пятен. После этого матрикс для MALDI добавлялся непосредственно к содержимому чипа. В результате одновременно удавалось считывать информацию о молекулярном весе и изоэлектрической точке данного пептида.
7. Двумерный электрофорез:
При исследовании белков методом 2Д электрофореза, целью исследования является:
· обеспечить воспроизводимое разделение основных известных белков, характерных для данной ткани;
· показать присутствие известных минорных белков;
· выявить и идентифицировать маркерные белки, характеризующих известные изменения в данной ткани.
Для достижения цели решают следующие задачи:
1) Все белки, содержащиеся в изучаемом образце, подвергаются солюбилизации и становятся объектами анализа;
2) Проводится аналитическое фракционирование по двум независимым друг от друга физико-химическим свойствам полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной структуры - комбинированное использование – двумерный гель-электрофорез (2D):
· Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), обеспечивает фракционирование по pI.
· Электрофорез в присутствии SDS (SDS-ЭФ) обеспечивает разделение по Mm.
3) Выявление белковых фракций после разделения с помощью высокочувствительных методов детекции белков (различные модификации масс-спектрометрии).
4) Стандартизированное описание белков на двумерных электрофореграммах в системе прямоугольных координат, в которых одна из координат являться функцией молекулярной массы, а другая – изоэлектрической точкой для каждого вида полипептидных цепей.
· Солюбилизация,
· подбор оптимальных условий
· Повышение разрешения – использование иммобилиновых стрипов
3. II направление (SDS PAGE)
· Повышение разрешения – увеличение размера геля
· Чувствительность,
· избирательность детекции/окраски
· Компьютерный анализ изображений
6. Вырезание отдельных белковых пятен
· Точность попадания
7. Идентификация белков
· Масс-спектрометрия
· Интерпретация данных
· Сравнение с другими базами данных
Современная протеомика имеет почти 30-ти летнюю историю, началом которой стали разработки метода двумерного электрофореза белков и создание системного подхода в исследованиях белковых продуктов генной экспрессии. Протеомика располагает внушительным методическим арсеналом и большими ресурсами по биоинформатике. Это позволяет надеяться, что прогресс в протеомных исследованиях человека (в сочетании с прогрессом в других областях функциональной геномики) качественно усилит потенциал современной клинической биохимии.
Протеомика является важнейшим источником новых знаний о белках человека, которые необходимы для клинической биохимии, поскольку на основе этих знаний формируются и детализируются представления о молекулярных основах различных болезней, а также расширяются диагностические возможности современной медицины.
Литература:
6. Остерман исследования белков и нуклеиновых кислот. Москва, Наука, 2002.
7. Карягина. Клинико-диагностическая интерпретация электро-фореграмм белков сыворотки крови. Учебно-методическое пособие. - СПб. Изд-во СПбГУ, 2000.
8. N. G.Anderson, N. L.Anderson. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis, (1996) 17, pp. 443-453.
9. Rob Haselberg ∗, Gerhardus J. de Jong, Govert W. Somsen. Capillary electrophoresis–mass spectrometry for the analysis of intact proteins. Journal of Chromatography, (20pp 81–109
10. Jurgen Cox and Matthias Mann. Is Proteomics the New Genomics? Cell 130, (2007) pp 395-398.
11. Wikipedia: http://en. wikipedia. org/
